Ревматоидный артрит (РА) —  неизлечимое на сегодняшний день иммуновоспалительное заболевание с многофакторной этиологией, от которого страдает до 1,0% населения Земли [1], его распространенность увеличивается с возрастом. По данным официальной статистики, в 2017 г. в России зарегистрировано более 300 тысяч пациентов с РА [2]. Его прогрессирование приводит к деформации суставов, разрушению хрящевой и костной ткани и последующей инвалидизации.

В настоящее время в лечении РА доминирует стратегия «лечение до достижения цели» («treat to target», T2T) [2, 3]. Она не рекомендует какие-то конкретные препараты, а дает лишь общие рекомендации по проведению лечения. Основная цель фармакотерапии РА —  достижение ремиссии заболевания [2]. Для этого используются несколько классов лекарственных средств: базисные противовоспалительные препараты (БПВП), представляющие собой обширную группу синтетических и биологических препаратов, которые объединяет их способность влиять на патогенетические механизмы РА; глюкокортикоиды, которые рекомендуется применять в комбинации с БПВП, а для снятия острых и хронических болей используются нестероидные противовоспалительные препараты [4].

Лечение ревматоидного артрита является длительным процессом, а лекарственные средства, используемые для его лечения, далеко небезопасны и не всегда обладают значимой эффективностью. В среднем 20–50% пациентов вынуждены прекращать терапию вследствие отсутствия эффективности либо непереносимости назначенных медикаментов [5]. Поэтому существует острая необходимость в разработке новых фармакологических мишеней, при воздействии на которые повышалась бы эффективность и снижалась токсичность применяемых лекарств.

Одной из перспективных терапевтических мишеней являются протеиназа-активированные рецепторы (proteinase-activated receptors, PARs). Они относятся к классу связанных с G-белком рецепторов. Определяющей особенностью этих рецепторов является их необратимая активация протеазами. Обнаруженные в 1990-х гг. четыре формы PARs (PAR1, PAR2, PAR3 и PAR4) экспрессируются на мембране клеток практически всех органов и систем и регулируют многочисленные физиологические функции, в том числе сокращение гладкомышечных клеток, чувствительность к боли, высвобождение липидных медиаторов, цитокинов, нейропептидов. Активация PAR2 связана с клиническими проявлениями в виде воспаления, отека, боли. Они экспрессируются в иммунных клетках как врожденной, так и адаптивной иммунной системы и играют немаловажную роль в развитии широкого круга заболеваний [6]. Их активация способствует возникновению воспаления, фиброза и разрастанию соединительной ткани. Эксперименты продемонстрировали, что ингибирование активности PAR2 препятствует развитию патогенеза РА и положительно модифицирует течение заболевания [6]. Поиск лекарственных средств, ингибирующих PAR2, идет по следующим направлениям: косвенная блокада активности PAR2; создание моноклональных антител; поиск ингибиторов PAR2 среди пептидных соединений; синтез низкомолекулярных веществ-ингибиторов. Последнее направление считается наиболее перспективным [7].

В течение 2016–2019 гг. был осуществлен синтез низкомолекулярных антагонистов PAR-2, относящихся к производным 4,5-дигидроизоксазол-5-карбоксамида. Работа проводилась на основании предварительного математического прогнозирования фармакологически значимых свойств большого ряда многоядерных производных имидазола, изоксазола и оксазола с широким структурным разнообразием.

Антагонистическая активность соединений по отношению к PAR-2 оценивалась in vitro на клеточной линии CHO с высокой экспрессией человеческого PAR-2 [8]. Пять наиболее активных антагонистов PAR-2 —  производных 4,5-дигидроизоксазол-5-карбоксамида, структура которых представлена на рисунок, в различных дозировках были исследованы in vivo на модели формалинового отека. Это позволило выбрать наиболее активное соединение для его тестирования на модели хронического аутоиммунного воспаления [9].

Цель исследования: определить потенциальную терапевтическую эффективность перспективного соединения из ряда производных амидов 3-имидазолзамещенной-4,5-дигидроизоксазолкарбоновой кислоты на модели аутоиммунного воспаления у крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Хронический воспалительный процесс воспроизводился при помощи однократного подкожного введения пристана в основание хвоста крысы в объеме 0,1 мл [10], после чего у белых крыс развиваются патологические изменения, характерные для ранних стадий развития РА: имеет место хроническое рецидивирующее течение процесса, характерные гистологические признаки поражения суставов, а также развитие специфических серологических иммунных аномалий [10].

В эксперименте было использовано 50 белых беспородных крыс массой тела 180–220 г, содержащихся при температуре 22±2 C^о, влажности 55±5%, в 12/12 часовом световом цикле, с неограниченным доступом к пище и воде. Все животные были подразделены на 5 групп по 10 крыс в каждой: первая группа —  интактные животные; вторая группа —  контрольная (крысам вводили пристан и физиологический раствор); крысам третьей группы вводили пристан + диклофенак натрия в дозе 5 мг/кг [11]; крысам четвертой группы вводили пристан + дексаметазон 1 мг/кг [10]; животным пятой группы вводили пристан + соединение R004 10 мг/ кг. Продолжительность эксперимента была 28 суток; препараты вводились ежедневно: дексаметазон подкожно, физ. раствор, диклофенак натрия и R004 внутрижелудочно. Динамическое обследование животных проводилось 5 раз: исходно и на 7, 14, 21 и 28 сутки эксперимента. Изучались следующие параметры: объем пораженной стопы при помощи цифрового безводного плетизмометра PH1901 (Россия), ширина межсуставных щелей при помощи цифрового рентгена нижних конечностей (только на 28 сутки) [12], ректальная температура, общий анализ крови, биохимические показатели (общий белок, альбумины, глобулины, глюкоза, триглицериды, общий холестерин, АлАТ, АсАТ, общий билирубин, ГГТ, щелочная фосфатаза, креатинин, мочевина) крови.

Результаты подвергались статистической обработке при помощи программы Biostat. Количество определений каждого показателя в различных опытах составляло 6–10.

Для межгрупповых сравнений использовался критерий t Стьюдента (при наличии нормального распределения) и непараметрический критерий Уилкоксона (при его отсутствии), для множественных сравнений использовался критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Достоверность внутригрупповых различий определялась по парному критерию t Стьюдента. Различия считали достоверными при p < 0,05 [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из исследуемых показателей наиболее специфично отражают процесс воспаления у крыс динамика ректальной температуры и объема лапы животных, а также ширина межсуставной щели их стоп.

В интактной группе на протяжении всего эксперимента имели место недостоверное изменение объема стоп (табл. 1). При введении белым крысам пристана на 14 сутки имело место достоверное повышение объема правой стопы от исходного уровня на 5,5% и среднее значение обеих стоп на 3,8%. На 21 сутки эксперимента достоверно повышался по отношению к исходному уровню объем обеих стоп: правой —  на 7,6%, левой —  на 3,1%; на 28 сутки объем правой стопы и обеих стоп оставались достоверно повышенными на 5,2% и на 2,7% соответственно. По отношению к здоровым животным у крыс на 14–28 дни пристанового воспаления объем стоп был достоверно увеличен на 6,5–11,2%.

При лечении крыс диклофенаком натрия достоверное повышение объема стоп (правой и среднее значение) по отношению к исходному уровню имело место только на 21 день опыта на 5,6% и 4,7%. На 28 сутки объем стоп крыс по отношению к исходному состоянию нормализовался, однако правая стопа стала достоверно объемней (+12%), чем у интактных животных. При лечении крыс дексаметазоном у них наблюдалось не повышение объема стоп, а, наоборот, начиная с 7 дня эксперимента и его до конца имело место достоверное снижение объема стоп по отношению к исходному уровню на 9,4–13,4% и по отношению к контрольной группе на 9,3–16,6%. При введении животным R004 достоверного нарастания объема стопы не наблюдалось и, более того, объем лап леченных крыс был достоверно ниже на 7,5–18,7%, чем в контроле и, одновременно, не отличался от таковых в интактной группе (табл. 2).

Эксперимент показал, что при введении животным пристана у них развивается хроническое воспаление, которое сопровождается отечностью лап. Диклофенак натрия уменьшал (но полностью не предупреждал) выраженность воспалительного процесса; его лечебный эффект был более выражен в первые три недели развивающегося процесса, а затем несколько снизился (на фоне его введения имело место достоверное повышение объема правой лапы крысы на 21 день и достоверное повышение ее объема по отношению к интактным животным на 28 день). Дексаметазон полностью блокировал процесс развития воспалительной отечности, но, одновременно, достоверно снижал объем лап крыс как по сравнению с исходным состоянием, так и по отношению к интактному контролю на 4 и 14 дни эксперимента. Это может являться свидетельством развития дексаметазоновой миопатии вследствие нарушения синтеза мышечных белков. Лечение крыс R004 было оптимально: у животных не наблюдалось достоверного нарастания отека стоп как при сравнении с исходным состоянием, так и по отношению к здоровым крысам.

Моделирование аутоиммунного воспаления пристаном вызывало поражение ткани суставов белых крыс, одним из проявлений которого было рентгенологическое изменение ширины суставной щели (табл. 2) —  она достоверно уменьшалась на 11,1% в предпюсне-плюсневым и на 11,3% плюсне-фаланговом суставах; в межфаланговом суставе ее сужение наблюдалась в виде тенденции (–11,5%). Диклофенак натрия в данном случае не обладал терапевтической активностью: ширина суставной щели плюсне-фаланговом и плюсне-фаланговом суставах изменялась практически в той же степени, как в контроле (–12,7% и –13,2%), а в предпюсне-плюсневом суставе даже наблюдалось ухудшение: ширина межсуставной щели была достоверно меньше не только по отношению к интактным животным (–20%), но и по отношению к контролю (–9,7%). Дексаметазон также не обладал терапевтической активностью: ширина суставной щели достоверно уменьшалась на 16,4% в предпюсне-плюсневом и на 18,7% плюсне-фаланговом суставах, а в межфаланговом суставе сужение суставной щели наблюдалась в виде тенденции (–11,4%). Введение R004 снижало степень сужения суставной щели: достоверно на 9,8% по отношению к здоровым животным это происходило только в предпюсне-плюсневом суставе. В то же время изменения ширины суставной щели в плюсне-фаланговом суставе не достигли уровня достоверности (–9,5%), а в межфаланговом суставе они отсутствовали. Здесь она была достоверно шире на 10,8% по отношению к контролю и на 11,9% по отношению к группе дексаметазона.

Таким образом, опыт показал, что при развитии пристанового воспаления происходит поражение суставных поверхностей. Применение диклофенака натрия и дексаметазона оказалось безрезультатно; R004 частично препятствовал поражающему действию пристана на суставную ткань.

Измерение ректальной температуры у белых крыс оказалось малоинформативным показателем: ее динамика во всех исследуемых группах фактически не отличалась от таковой у интактных животных.

Анализ крови у животных проводился в динамике —  исходно до начала введения пристана и на 28 сутки эксперимента. В интактном контроле за время эксперимента наблюдалось повышение всех показателей белой крови, но достоверно только эозинофилов на 51% и моноцитов на 80%. После введения пристана для большинства исследуемых показателей качественная картина не изменилась, лишь два показателя достоверно отличались от таковых в интактном контроле: происходило более резкое в 2,5 раза от исходного (р < 0,05) повышение уровня нейтрофилов, а содержание лимфоцитов снизилось на 35% (табл. 3).

На фоне применения диклофенака натрия происходило еще большее повышение содержания нейтрофилов в крови (в 4 раза по отношению к исходному, р < 0,05) и почти в 2 раза снизился здесь уровень лимфоцитов (р < 0,05). Дополнительно к этому в крови перестали определяться базофилы. При использовании дексаметазона имела место тенденция к снижению содержания лейкоцитов (в остальных группах их содержание повышалось), в 4 раза увеличивалось содержание нейтрофилов, но в 20 раз падал уровень лимфоцитов. В крови перестали определяться базофилы и эозинофилы. Введение R004 нивелировало изменения крови, спровоцированные пристаном: ни один из изучаемых показателей не обладал достоверной динамикой. Качественные отличия животных данной группы от интактных крыс заключались в тенденции к снижению у них содержания в крови базофилов и лимфоцитов, а достоверные количественные различия касались только лимфоцитов: их уровень в группе R004 по отношению к интактным животным был ниже на 36,2% при практически равном исходном уровне (табл. 3).

Таким образом, достоверное повышение в контрольной группе крыс содержания в крови нейтрофилов и снижение здесь содержания лимфоцитов свидетельствуют о заинтересованности иммунной системы. Лечебное применение R004 до некоторой степени нивелирует данные процессы, чего нельзя сказать о препаратах-эталонах. На фоне использования диклофенака натрия данные изменения усугублялись (к падению уровня лимфоцитов добавлялись моноциты и базофилы), а дексаметазон сам по себе обладал значимой иммуннодепрессивной и лимфотоксической активностью, способствуя еще большему изменению исследуемых параметров.

Анализируя полученные данные в отношении красной крови, можно отметить, что введение пристана практически не оказало отрицательного влияния на ее показатели.

Обмен белков, жиров и углеводов. Введение пристана привело к изменению баланса белкового обмена — н есмотря на то, что изменение содержания в крови альбуминов и глобулинов носит характер тенденции, достоверное снижение альбумин/глобулинового индекса (АГИ) на 13,9% свидетельствует о сдвиге синтеза белка в сторону глобулинов, к которым структурно относятся и антитела, играющие важную роль в аутоиммунном воспалении. Также имело место достоверное снижение в крови концентрации глюкозы на 9,7% и холестерина на 23,6% (снижение скорости синтеза стероидных гормонов и репарации клеточных мембран). На фоне снижения концентрации глюкозы и тенденции к повышению содержания ТГ достоверно на 30% уменьшился углеводно-жировой индекс (УЖК —соотношение уровней глюкозы и триглицеридов), что свидетельствует о переключении организма на «жировую» энергетику, более расходную в плане кислорода и энергетических субстратов (табл. 4).

Применение диклофенака натрия вызывало равномерное снижение синтеза как альбуминов, как и глобулинов, что может быть связано с нарушением функций печени. Также имело место дальнейшее снижение УЖК на 37,4% по сравнению с интактными животными, что свидетельствует об усилении липидной составляющей энергетического баланса организма. На фоне использования дексаметазона усиливался диссонанс в пользу синтеза глобулинов (достоверное по отношению к здоровым животным снижение АГИ на 19,5%) и резко почти в 5 раз снижался УЖК, что свидетельствует о переходе организма преимущественно на «липидную» энергетику (действие высоких доз глюкокортикоидов). Терапевтическое введение R004 купирует изменения в обмене белков, жиров и углеводов, возникающие на фоне пристанового воспаления.

Функциональная биохимия печени и почек. При введении пристана имело место достоверное повышение в крови активности АсАТ на 35,7% и содержания креатинина на 14% (табл. 4). Это свидетельствует о возможной заинтересованности печени и почек в развивающемся воспалительном процессе. На фоне введения R004 наблюдалось лишь достоверное повышение содержания креатинина в крови (+9,8%), но в меньшей степени, чем в контроле. При использовании диклофенака натрия у больных животных достоверно повышались лишь содержание в крови креатинина (+9,9%) и мочевины (+25,4%), что свидетельствует о возможном поражении почек. Тенденция к повышению активности в крови обеих трансаминаз и щелочной фосфатазы, а также к увеличению концентрации билирубина говорит о напряжении функций печени. На фоне применения дексаметазона наблюдались достоверное повышение активности АлАТ почти в 2 раза, АсАТ —  в 1,6 раза, ГГТ —  в 1,8 раза и щелочной фосфатаза — в  3,1 раза (последнее р > 0,05), что свидетельствует о цитолизе гепатоцитов и развивающемся холестазе. Достоверное повышение содержания в крови мочевины показывает на снижение реабсорбционной функции почек.

Таким образом, эксперимент показал, что при развитии пристанового воспаления возможно поражение печени и почек. Введение R004 ослабляет этот процесс, а применение диклофенака натрия и дексаметазона его усиливает.

ВЫВОДЫ

1. Применение соединения R004 в терапии хронического воспаления у крыс препятствовало значимому развитию отека стоп и поражению мелких суставов, предупреждало специфические изменения формулы белой крови, а по данным биохимического исследования крови приводило к нормализации функций печени и почек и энергетического обмена организма.
2. Соединение R004 оказалось более эффективно и безопасно, чем препараты сравнения диклофенак натрия и дексаметазон.