Новый селективный ингибитор карбоангидразы II типа 4-(5-метил-1,3,4-оксадиазол-2-ил)-бензолсульфонамид (ODASA) (рис. 1А) является новой перспективной молекулой для терапии открытоугольной глаукомы. Данное соединение находится на этапе доклинического исследования. Он способен снижать внутриглазное давление при местном применении. Это уменьшает количество системных нежелательных лекарственных реакций. Продолжительность эффекта ODASA сохраняется около 24 ч [1]. В настоящее время разработана 1% глазная суспензия данного соединения. Величина ее относительной биодоступности (ОБ) у крыс после глазной инстилляции по сравнению с внутрибрюшинной инъекцией составляет более 80%. После попадания в системный кровоток молекула ODASA подвергается гидроксилированию. Реакция проходит по метильной группе цикла 1,3,4-оксадиазола с образованием основного метаболита 4-[5-(гидроксиметил)-1,3,4оксадиазол-2-ил]-бензолсульфонамида (М1) (рис. 1Б) и по сульфонамидной группе с образованием минорного метаболита N-гидрокси-4-(5-метил-1,3,4-оксадиазол-2-ил)-бензолсульфонамида (М2) (рис. 1В) [2].

Согласно регуляторным требованиям, исследование фармакокинетики и биодоступности следует проводить на двух видах животных, один из которых не относится к грызунам [3]. Для данных целей наиболее часто применяют кроликов. Они являются наиболее экономически доступными [4–7]. Гораздо реже в качестве второго вида используют собак породы бигль [8–9], минипигов [10–11] и обезьян [12–14]. Из-за нерастворимости субстанции ODASA в воде ее внутривенное введение и, как следствие, изучение абсолютной биодоступности невозможно. Поэтому расчет ОБ данного соединения выполнялся после внутрибрюшинной инъекции.

При проведении фармакокинетических исследований анализ образцов биоматериала наиболее часто проводят с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). Для количественного определения ODASA и его гидроксилированных производных в плазме крови лабораторных животных разработана экспрессная методика с применением данного метода. Подготовка проб осуществлялась с помощью осаждения белков. Минорный метаболит N-гидрокси-4-(5-метил-1,3,4оксадиазол-2-ил)-бензолсульфонамид является химически неустойчивым в биологических объектах. Поэтому после отбора образцов плазмы необходима их стабилизация 10%-ным раствором аскорбиновой кислоты [2].

Таким образом, целью работы является расчет фармакокинетических параметров и величины относительной биодоступности глазной суспензии 4-(5-метил-1,3,4-оксадиазол-2-ил)-бензолсульфонамида на кроликах c применением ВЭЖХ-МС/МС для анализа образцов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводилось на кроликах-самцах породы «Советская шиншилла» (питомник ООО «СМК Стезар») возрастом 3–4 месяца. Для изучения ОБ использовался параллельный дизайн. Это обусловлено депонированием ODASA в эритроцитах и его длительным периодом полувыведения [2]. Согласно этическим принципам, объем выборки был минимально допустимым для проведения фармакокинетических исследований [3, 15].

Животные содержались в виварии в комфортных условиях в индивидуальных клетках. Доступ к воде и комбикорму был свободным за исключением 4 часов до введения и 2 часов после введения изучаемого препарата. Вмешательства по отбору крови являлись кратковременными и не причиняли сильных страданий. Поэтому специальных мер по обезболиванию не применялось. Данное исследование получило одобрение независимого этического комитета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Ярославский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, протокол от 20.04.2025 № 2.

Первой группе испытуемых, включающей в себя 6 кроликов массой 2,84±0,05 кг (M±SEM), проводили инстилляцию 1% глазной суспензии (И/Г) ODASA в каждый глаз в объеме около 40 мкл. Это соответствовало дозе 0,28 мг/кг. Другим 6 особям массой 3,13 ± 0,05 кг (M±SEM) выполняли внутрибрюшинное введение лекарственного препарата (В/Б) в эквивалентном количестве. Пробы крови отбирались из ушной вены в объеме 0,2 мл с помощью инсулинового шприца, как и в других подобных исследованиях [4–6].

Образцы получали до введения суспензии ODASA и через 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч, 144 ч, 192 ч, 240 ч, 288 ч после ее введения. В качестве антикоагулянта использовался К₃ЭДТА. Полученную после центрифугирования плазму стабилизировали 10%-ным раствором аскорбиновой кислоты в объемном соотношении 1: 2 (раствор аскорбиновой кислоты: плазма). Образцы хранили при температуре не выше –70 °C до момента проведения анализов.

Количественное определение ODASA и его метаболитов в плазме проводили с помощью валидированной биоаналитической методики. Подготовку проб выполняли путем осаждения белков метанольным раствором внутреннего стандарта 4-(3-метил-6-оксо5,6-дигидропиридазин-1(4H)-ил)-бензолсульфонамида. Для этого 100 мкл реактива добавляли к 20 мкл стабилизированной плазмы. Смесь перемешивали и центрифугировали 5 мин при 10 000 об./мин. Надосадочную жидкость переносили в микровставки и анализировали. Для этого использовали ВЭЖХ-МС/ МС-систему, включающую в себя хроматограф Agilent 1260 Infinity (Германия) и масс-спектрометр «AB Sciex QTRAP5500» (Сингапур). Для хроматографического разделения применяли колонку Kinetex Phenyl-Hexyl (50*4,6 мм, 2,6 мкм) с предколонкой Phenyl SecurityGuard Ultra Catridge (4,6 мм, 2,6 мкм). Детектирование аналитов и внутреннего стандарта выполняли в MRM-режиме [2]. Аналитический диапазон измеряемых в плазме концентраций для ODASA и M1 составлял 2–2000 нг/мл, для М2–0,5–500,0 нг/мл.

При расчете фармакокинетических параметров использовался некомпартментный подход. С помощью программного пакета R v. 3.3.2 (модуль Bear v. 2.7.7) для ODASA и его метаболитов были рассчитаны максимальная концентрация в плазме (C_max), время ее достижения (T_max), площадь под фармакокинетической кривой, начиная с момента введения препарата и заканчивая временем отбора последнего отбора крови (AUC_0-t), площадь под фармакокинетической кривой, начиная с момента введения препарата до бесконечности (AUC_0-∞), период полувыведения (Т_1/2), среднее время удержания в крови (среднее резидентное время (MRT)), кажущийся объем распределения (Vd/F), кажущийся клиренс (Сl/F).

Вычисление степени превращения (R(M)) действующего вещества в метаболит проводилось по формуле:

формула

где AUC_0-∞ (M) — значение AUC_0-∞ метаболита в плазме; AUC_0-∞ (ЛС) — значение AUC_0-∞ ODASA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Максимальная концентрация в плазме у ODASA при терапевтическом способе применения достигала 58,6 ± 7,2 нг/мл (М ± SEM) спустя 1 ч после введения (таблица). Через 48 ч содержание действующего вещества в данной биологической жидкости было ниже предела количественного определения методики (LLOQ) (рис. 2А). Величина ОБ для ODASA после И/Г по сравнению с В/Б составила 30,76%. Это примерно в 2,5 раза меньше, чем ОБ данного соединения у крыс. Период полувыведения ODASA при обоих способах введения был более чем в 6 раз короче, чем у крыс [2].

T_max основного метаболита М1 после И/Г наступало позже, чем T_max ODASA и М2. Он детектировался в плазме на протяжении 120 ч эксперимента (рис. 2Б). Продолжительность его T_1/2 была примерно в 1,5 раза меньше, чем у крыс [2]. Пик концентрации N-гидроксипроизводного наблюдался в промежуток с 1 ч до 2 ч после инстилляции суспензии, как и у действующего вещества (рис. 2В). Значение T_1/2 М2 в случае И/Г составляло около 10 ч. Это приблизительно в 3 раза короче, чем у крыс [2]. Концентрации данного соединения в плазме крови были ниже LLOQ методики спустя 24 ч после И/Г и 48 ч после В/Б.

У ODASA и его метаболитов в эксперименте на кроликах наблюдались высокие значения кажущегося объема распределения (таблица). Они значительно превышали фактический объем циркулирующей крови. Это указывает на то, что изучаемые соединения хорошо проникают в органы и ткани животных.

Степень превращения ODASA в метаболит М1 при терапевтическом способе введения у кроликов составила 2,122 ± 0,292, в метаболит М2 — 0,106 ± 0,017 (M ± SEM). Это приблизительно в 10 раз больше величин R(M) данных продуктов гидроксилирования действующего вещества, рассчитанных у крыс. Такая разница, вероятно, связана с более низкой дозой на единицу массы тела и меньшими концентрациями ODASA в плазме. Активные центры микросомальных ферментов были менее насыщены, и биотрансформация ODASA происходила значительно быстрее. По этой причине величина клиренса ODASA у кроликов после И/Г более чем в 40 раз выше, чем у крыс [2].

Таким образом, ODASA достаточно хорошо всасывался в системный кровоток кроликов после закапывания в глаза его суспензии. В исследовании фармакокинетики, выполненном на крысах, также измерена высокая величина ОБ действующего вещества. Поэтому в случае, если данный препарат будет допущен до первой фазы клинических испытаний, изучение его фармакокинетики на здоровых добровольцах будет обязательным.

ВЫВОДЫ

1. ODASA способен проникать в системный кровоток кроликов после глазной инстилляции его суспензии.
2. Величина относительной биодоступности ODASA после закапывания в глаза по сравнению с внутрибрюшинным введением составила 30,76%.
3. Установлены межвидовые различия в скорости выведения ODASA и его метаболитов из плазмы крови: у кроликов данный процесс происходит быстрее, чем у крыс.
4. Из-за всасывания ODASA при местном применении у животных в перечень испытаний первой фазы его клинических исследований необходимо включать изучение фармакокинетики.